В экспериментальных методах классической химии, биохимии и биофизики наблюдения проводятся на системе, состоящей из огромного числа молекул. Получаемые данные характеризуют усредненные свойства молекул изучаемой системы. При этом из-за усреднения теряется значительная часть информации об изучаемой системе. (Простой пример: для таких разных наборов чисел, как "2, 5, 5" и "0, 4, 8" среднее значение одинаково и равно 4.)
В живом организме важные реакции, регулирующие жизнедеятельность, протекают именно между отдельными молекулами – ДНК и ДНК-полимеразой, миозином и актином, антителом и антигеном, рецептором и лигандом. Для биологических макромолекул, которые в ходе выполнения своей роли переходят из одного функционального состояния в другое, зачастую невозможно выяснить классическими методами ни количество этих состояний, ни последовательность перехода из одного в другое, ни время жизни каждого состояния. Методы изучения единичных молекул позволяют решить эти задачи.
В последние годы все больше и больше новых экспериментальных данных в биологии дает изучение свойств и межмолекулярного взаимодействия отдельных биологических молекул. Данный курс кратко освещает историю и общие принципы таких методов изучения единичных молекул, как флуоресцентная микроскопия (конфокальная и TIRF-микроскопия), зондовая (в том числе, атомная силовая) микроскопия, криоэлектронная микроскопия и др. Для каждого метода разбираются его сильные и слабые стороны, возможности и ограничения. Кроме того, приводятся примеры использования этих подходов для получения информации, недоступной при использовании классических методов исследования.
Список всех тем лекций
Лекция 1. Вступительная.
Методы исследования единичных биологических молекул
Ensemble averaging problem
Усреднение по времени
Миозин 5
HS-AFM imaging
Первые SM-эксперименты
Некоторые общие минусы SM-методов
Почему мы не можем увидеть отдельные молекулы в световой микроскоп?
Как добиться высокого разрешения?
Пришивание флюорофора
FRET
Проблема фона
Лекция 2. Флуоресцентная микроскопия.
Повторение
Флуоресцентная микроскопия
Габриэль Стокс
Время флуоресценции
Поляризация флуоресценции
Яркость флуоресценции
Фотообеспечивание
Чувствительный детектор
Лавинный фотодиод
Шум
Отношение сигнал-шум
Фотонный шум на фотографии
Минимизация фона
Микроскопия затухающего поля
Исследование АТФ-синтазы
Лекция 3. Флуоресцентные молекулы для SM-методов.
Флуоресцентные молекулы для SM-методов
Квантовые точки
Флуоресцентные белки
Исторический экскурс
GFP
mPlum
Katushka
Разнообразие флуоресцентных белков
UnaG
Blinking
Photostability
Сенсоры на основе флуоресцентных белков
ATeam
Фосфолипаза С
Лекция 4. Фёрстеровский перенос энергии (FRET).
FRET
Что происходит в процессе возбуждения?
Typical value of R0
Разрешение
Влияние взаимной ориентации флюорофоров на эффективность FRET
Биосенсоры на основе FRET
Single-molecule FRET
Пример с рибозимом
Денатурация-ренатурация
Пример с АТФ-синтазой
Графики для гидролиза и синтеза АТФ
Еще пример с АТФ-синтазой
Лекция 5. Микроскопия сверхразрешения.
Повторение
Микроскопия сверхразрешения
FIONA
STORM
Минусы метода
PALM
Reconstructions
STED microscopy
Преимущества
Применение флуоресцентных зондов в живых клетках
Проблемы микроинъекций
Внутриклеточное введение низкомолекулярных флюорофоров
Лекция 6. Манипуляции с биологическими молекулами.
Манипуляции с биологическими молекулами
Оптический пинцет
Иоганн Кеплер
Физический принцип
г
Необходимые условия для оптического пинцета
Минимизация шума
Калибровка силы
Пример
Насколько инвазивен оптический пинцет?
Магнитная ловушка
Калибровка силы
Топоизомеразы
модели механизма инициации
АТФ-синтаза
Лекция 7. Сканирующая зондовая микроскопия.
Сканирующая зондовая микроскопия
Ideal STM tip
Feed-back loop
Features of Piezoelectric Positioning Systems
Creep
Растровое "изображение"
L и D серин
Общие принципы сканирующей зондовой микроскопии
Ближнепольная оптическая микроскопия
Устройство
Атомная силовая микроскопия
Кривые подвода зонда к поверхности и кривые отвода
Недостаток контактных АСМ методик
Бесконтактные колебательные методы
"Полуконтактный" режим
Борьба с шумом
Конечный размер зонда
АТФ-синтаза
Фотосинтетические мембраны
Сетчатка глаза
High-speed AFM
Лекция 8. Исследование единичных биологических молекул в живой клетке.
Исследование единичных биологических молекул в живой клетке
In vitro
Введение метки
Через биотин и стрептавидин
Модификация аминогруппы гидроксисукцинимидом
In vivo
Флуоресцентные белки
Проблемы
Белковые теги
AGT tag
Квантовые точки
Проблема минимизации объема наблюдения
TIRF
SPIM
HILO
Резюме
Флуоресцентные белки
Изучение трансляции
Добавка пуромицина
Результаты
Подвижность полисом
Что делать, если расстояние между единичными биомолекулами меньше 200нм?
PALM
Меньше света
MINFLUX
![Методы исследования единичных биомолекул](/img/hd/course/research-methods-for-single-biomolecules.jpg?361)