В экспериментальных методах классической химии, биохимии и биофизики наблюдения проводятся на системе, состоящей из огромного числа молекул. Получаемые данные характеризуют усредненные свойства молекул изучаемой системы. При этом из-за усреднения теряется значительная часть информации об изучаемой системе. (Простой пример: для таких разных наборов чисел, как "2, 5, 5" и "0, 4, 8" среднее значение одинаково и равно 4.) 

В живом организме важные реакции, регулирующие жизнедеятельность, протекают именно между отдельными молекулами – ДНК и ДНК-полимеразой, миозином и актином, антителом и антигеном, рецептором и лигандом. Для биологических макромолекул, которые в ходе выполнения своей роли переходят из одного функционального состояния в другое, зачастую невозможно выяснить классическими методами ни количество этих состояний, ни последовательность перехода из одного в другое, ни время жизни каждого состояния. Методы изучения единичных молекул позволяют решить эти задачи. 

В последние годы все больше и больше новых экспериментальных данных в биологии дает изучение свойств и межмолекулярного взаимодействия отдельных биологических молекул. Данный курс кратко освещает историю и общие принципы таких методов изучения единичных молекул, как флуоресцентная микроскопия (конфокальная и TIRF-микроскопия), зондовая (в том числе, атомная силовая) микроскопия, криоэлектронная микроскопия и др. Для каждого метода разбираются его сильные и слабые стороны, возможности и ограничения. Кроме того, приводятся примеры использования этих подходов для получения информации, недоступной при использовании классических методов исследования.

Список всех тем лекций

Лекция 1. Вступительная.
Методы исследования единичных биологических молекул Ensemble averaging problem Усреднение по времени Миозин 5 HS-AFM imaging Первые SM-эксперименты Некоторые общие минусы SM-методов Почему мы не можем увидеть отдельные молекулы в световой микроскоп? Как добиться высокого разрешения? Пришивание флюорофора FRET Проблема фона

Лекция 2. Флуоресцентная микроскопия.
Повторение Флуоресцентная микроскопия Габриэль Стокс Время флуоресценции Поляризация флуоресценции Яркость флуоресценции Фотообеспечивание Чувствительный детектор Лавинный фотодиод Шум Отношение сигнал-шум Фотонный шум на фотографии Минимизация фона Микроскопия затухающего поля Исследование АТФ-синтазы

Лекция 3. Флуоресцентные молекулы для SM-методов.
Флуоресцентные молекулы для SM-методов Квантовые точки Флуоресцентные белки Исторический экскурс GFP mPlum Katushka Разнообразие флуоресцентных белков UnaG Blinking Photostability Сенсоры на основе флуоресцентных белков ATeam Фосфолипаза С

Лекция 4. Фёрстеровский перенос энергии (FRET).
FRET Что происходит в процессе возбуждения? Typical value of R0 Разрешение Влияние взаимной ориентации флюорофоров на эффективность FRET Биосенсоры на основе FRET Single-molecule FRET Пример с рибозимом Денатурация-ренатурация Пример с АТФ-синтазой Графики для гидролиза и синтеза АТФ Еще пример с АТФ-синтазой

Лекция 5. Микроскопия сверхразрешения.
Повторение Микроскопия сверхразрешения FIONA STORM Минусы метода PALM Reconstructions STED microscopy Преимущества Применение флуоресцентных зондов в живых клетках Проблемы микроинъекций Внутриклеточное введение низкомолекулярных флюорофоров

Лекция 6. Манипуляции с биологическими молекулами.
Манипуляции с биологическими молекулами Оптический пинцет Иоганн Кеплер Физический принцип г Необходимые условия для оптического пинцета Минимизация шума Калибровка силы Пример Насколько инвазивен оптический пинцет? Магнитная ловушка Калибровка силы Топоизомеразы модели механизма инициации АТФ-синтаза

Лекция 7. Сканирующая зондовая микроскопия.
Сканирующая зондовая микроскопия Ideal STM tip Feed-back loop Features of Piezoelectric Positioning Systems Creep Растровое "изображение" L и D серин Общие принципы сканирующей зондовой микроскопии Ближнепольная оптическая микроскопия Устройство Атомная силовая микроскопия Кривые подвода зонда к поверхности и кривые отвода Недостаток контактных АСМ методик Бесконтактные колебательные методы "Полуконтактный" режим Борьба с шумом Конечный размер зонда АТФ-синтаза Фотосинтетические мембраны Сетчатка глаза High-speed AFM

Лекция 8. Исследование единичных биологических молекул в живой клетке.
Исследование единичных биологических молекул в живой клетке In vitro Введение метки Через биотин и стрептавидин Модификация аминогруппы гидроксисукцинимидом In vivo Флуоресцентные белки Проблемы Белковые теги AGT tag Квантовые точки Проблема минимизации объема наблюдения TIRF SPIM HILO Резюме Флуоресцентные белки Изучение трансляции Добавка пуромицина Результаты Подвижность полисом Что делать, если расстояние между единичными биомолекулами меньше 200нм? PALM Меньше света MINFLUX